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    • 专利摘要:
    本發明係有關於一種微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，包括以下步驟：提供一微藻類樣本以及一基板，其中該基板表面覆蓋一金屬層；將該微藻類樣本塗佈於該基板之該金屬層表面；提供一近紅外光波長之雷射光激發該微藻類樣本；紀錄該微藻類樣本之拉曼散射訊號，以形成一拉曼光譜；以及根據一脂質檢量曲線，將該拉曼光譜中之脂質訊號的強度轉換成該微藻類樣本之總脂質總含量。
    公开号:TW201317576A
    申请号:TW100139131
    申请日:2011-10-27
    公开日:2013-05-01
    发明作者:Hsiang-Yu Wang；Tsung-Hwa Lee；Jo-Shu Chang
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:G01N21-00
    专利说明:
    微藻總脂質之近紅外光譜定量方法
    本發明係關於一種微藻總脂質之定量方法，尤指一種使用近紅外光譜對微藻總脂質之定量方法。
    一般生物樣本大多含有水分的組成，微藻類也不例外。若欲進行檢測分析，目前對於許多儀器而言，則需要進行繁複且耗費能源的前處理步驟，去除水分後才可以進行接下來的分析。
    對於微藻總脂質之檢測，目前主要使用的方法為乾重法或螢光光譜儀分析法。然而，此兩種分析方法對於樣本都有比較嚴苛的限制條件：就乾重法的分析方式而言，首先須將生物樣本去除水分，並將其細胞壁與細胞膜破壞，再藉由萃取或是純化將藻油分離出來並秤重，且需要耗費大量的微藻類樣本才有辦法測得其中的藻油量；若是以螢光光譜儀進行分析，藻種、染色時間、染劑濃度、以及許多實驗變數都會影響螢光強度，因此每一種樣本皆須經過校正後才能使用脂質檢量曲線進行定量。由此可知，這些傳統方法十分耗費時間與人力，且皆有其使用上的限制；除此之外，大多數的檢測方法屬於破壞性方法，也就是檢測後的微藻類細胞即死亡，無法留下偵測後的藻類續行培養。
    鑒於上述面臨的問題，若可發展出一種不破壞微藻類細胞、但仍可對其中的總脂質進行定量之方法的話，則將有利於研究者篩檢微藻類或即時掌控其培養狀況，以利生產微藻類而供生質燃料來源或其他應用。
    本發明之主要目的係在提供一種微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，俾能在不受水份影響、不破壞微藻細胞等前提下，定量微藻類內的總脂質總含量，達到即時監控微藻類之培養，進而可以及時改善微藻類的培養條件。
    為達成上述目的，本發明之一態樣提供一種微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，包括以下步驟：提供一微藻類樣本以及一基板，其中該基板表面覆蓋一金屬層；將該微藻類樣本塗佈於該基板之該金屬層表面；提供一近紅外光波長之雷射光激發該微藻類樣本；紀錄該微藻類樣本之拉曼散射訊號，以形成一拉曼光譜；以及根據一脂質檢量曲線，將該拉曼光譜中之脂質訊號的強度轉換成該微藻類樣本之總脂質總含量。
    於上述本發明所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法中，該微藻類樣本之樣本狀態沒有特別限定，例如可為乾燥樣本或漿態樣本。上述漿態樣本是指微藻類樣本中多餘水分已經被去除，例如以預定轉速或離心力離心一定時間，其中本發明領域中具有通常知識者，可以依通常知識決定預定轉速或離心力、以及離心時間，只要能達到去除樣本中多餘水分的目的即可，舉例如於10,000 rpm至20,000 rpm範圍內之轉速持續離心1分鐘至20分鐘。「乾燥樣本」是指已經去除微藻類樣本內所有水份，本發明領域中具有通常知識者，可以依通常知識決定預定乾燥手段，例如以冷凍乾燥法進行乾燥。此外，該近紅外光波長可介於750 nm至3200 nm，此波長亦可依通常知識參酌其功率而決定，例如施加70 mW功率之波長為785 nm的近紅外光。
    於上述本發明所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法中，該微藻類樣本之藻類沒有特別限定，舉例可為綠球藻屬(Chlorella)之藻類，如綠球藻(Chlorella vulgaris)。另外，雖然不同的微藻類可能會有不同的近紅外光譜，但脂質訊號峰位置基本上類似，因此對不同的微藻類體內總脂質的定量，亦可使用相似的脂質檢量曲線。此外，該微藻類樣本亦可先行經過缺氮處理，使藻體中因缺乏氮源而逐漸累積脂質，其中缺氮處理的方式，可直接將微藻類之培養基置換成不含氮源之培養基進行培養，或者其他同等方式亦可。
    於上述本發明所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法中，該脂質檢量曲線係一脂質訊號強度與脂質總含量的曲線，該脂質訊號可位於該拉曼光譜中介於800 cm-1至3200 cm-1之波數位移(wave number shift)範圍。若該微藻類樣本為乾燥粉末樣本時，則在上述拉曼光譜波數位移範圍中，以介於1400 cm-1至1600 cm-1之波數位移範圍、以及介於2700 cm-1至3100 cm-1之波數位移範圍較佳；若該微藻類樣本為漿態樣本時，該脂質訊號則以位於該拉曼光譜中介於2700 cm-1至3100 cm-1之波數位移範圍的脂質訊號較佳。
    上述脂質訊號的強度，可為單一波數位移之訊號峰強度，或者為一定波數位移範圍內之訊號峰總面積，且上述脂質總含量，係指相對於藻類乾重之脂質含量。此外，由於拉曼光譜內脂質訊號的強度除了受脂質含量的影響，亦會受微藻類細胞數的影響，因此測定微藻類脂質總含量時，可以使用以下兩種方式進行：一者為先用分光光度計將待測樣本調整成預定的透光密度(optical density)，再如上述方法利用近紅外光譜搭配脂質檢量曲線定出脂質總含量；另一者為先利用分光光度計測定不同微藻類樣本之透光密度(此數值即代表其中微藻細胞數量)，製作一個脂質訊號強度經過透光密度標準化(normalization)之脂質檢量曲線後，再如上述方法利用近紅外光譜搭配標準化的脂質檢量曲線定出脂質總含量。據此，於本案所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法中，該微藻類樣本之透光密度係做為校正拉曼光譜之標準訊號峰。由上述可知，因為水分不會對近紅外光譜內的訊號造成太大影響，所以樣本的狀態不會有太多限制，對於生物樣本如微藻類的檢測則相當方便。況且，近紅外光譜法中使用的入射光以及訊號擷取的波長範圍，通常不會受到微藻類內的自體螢光所影響，故無須對螢光訊號進行修正或是以光漂白(photo-bleaching)的手法去除螢光干擾，且並非所有物質皆會有近紅外光的訊號產生，因此減少其它物質訊號所造成不必要的干擾。
    除此之外，近紅外光譜儀相較於其它儀器而言，分析時間十分快速，可以利用批次或是連續偵測的方式完成偵測，這對於工業上或是學術上的應用而言是具有很大的優勢，可以即時了解微藻類細胞內的脂質總含量或是胞內組成，大幅減少分析脂質及胞內組成的時間，降低分析時藥劑以及能源或是時間上的成本；並且可以持續進行監測，若藻類組成有劇烈改變時，可以馬上得知，做出應對的措施，如將培養條件迅速控制成最適合的生長條件。
    綜上所述，本發明利用近紅外光譜儀快速偵測微藻體內之脂質總含量，進行即時監控與改善培養條件，且本發明所述方法屬於非破壞性技術(非侵略性的光學偵測)，微藻體即使在經過本發明所述方法處理後仍維持其活性，而有利於篩選具有活性或更具優勢的藻類進行後續培養。再加上，不同藻種產生的脂質，在近紅外光譜儀中測得的訊號皆可通用，因此不須對各種樣本進行校正。因此，利用本技術進行油量檢測可以節省人力以及時間和儀器上的成本。
    微藻樣本幾乎不需太多的前處理步驟即可進行分析，因此就產業應用上而言是十分便利的，而且近紅外光譜儀在操作介面可以設置成十分便捷的模式，因此人員僅需少許的訓練時間即可學會基本的操作模式，並只需要少量樣本即可進行分析檢測，不論是以批次或是連續式的方式皆可以擷取到所需要的數據。
    以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。 製備例一微藻類之培養
    綠球藻(Chlorella vulgaris)培養於基本培養基(basal medium)，此培養基中含限量硝酸鹽且以0.2 vvm(gas volume/culture volume/min，每單位體積之培養基中每分鐘的通氣體積)的通氣比，灌入2%至5%範圍內之預定濃度的二氧化碳。待所培養的綠球藻達到生長穩定期後，將培養基改成缺乏氮源之培養基，使綠球藻在缺乏氮源下累積細胞脂質(cellular lipids)。 以重量分析法(gravimetric method)進行脂質定量
    上述製備例1中累積脂質的綠球藻，測定波長685 nm之透光密度(optical density)，並將其透光密度調整至約為4.3至4.6範圍內之預定透光密度後，取200 mL至500 mL範圍內之預定體積的綠球藻懸浮液，以12,000 rpm至15,000 rpm範圍內之預定轉速，離心預定時間(約3分鐘至10分鐘範圍)，以去除多餘的液體，而後以冷凍乾燥處理，形成乾燥粉末樣本。
    脫水後的乾燥粉末樣本，浸入有機溶劑中，以萃取綠球藻其中之脂質。接著，收集有機溶劑並進行揮發，以移除其中的有劑溶劑，而後秤重所得的殘餘物，其為綠球藻樣本中所含的脂質總含量。此脂質總含量便是由習知重量分析法所測得的脂質總含量，其係做為參考值，以計算下述實施例一至四與實施例五之近紅外光譜法所得的結果。 實施例一至實施例四　以近紅外線光譜法(near-infrared spectrometry)進行乾燥樣本之脂質定量
    上述製備例一中累積脂質的綠球藻，先經過重量分析法測定後，確定四種綠球藻樣本中脂質總含量分別為各自綠球藻樣本乾重之5% wt(實施例一)、15% wt(實施例二)、30% wt(實施例三)、以及65% wt(實施例四)。
    將上述四種綠球藻樣本，以分光光度計測定波長685 nm之透光密度，並將其透光密度調整至約為4.3至4.6範圍內之預定透光密度後，取0.5 mL至2 mL範圍內之預定體積的綠球藻懸浮液，以12,000 rpm至15,000 rpm範圍內之預定轉速，離心預定時間(約3分鐘至10分鐘範圍)，以去除多餘的液體，而後以冷凍乾燥處理，形成乾燥粉末狀樣本。
    取一玻璃載玻片置於電子束蒸鍍機(E-beam evaporator，ULVAC，VT1-10CE，Japan)，於該玻璃載玻片表面形成一薄金膜(大約150 至250 )，如此則形成可用於近紅外線光譜測定脂質的基板。將上述經冷凍乾燥的綠球藻粉末，以一定的量鋪置在所製得之玻璃載玻片的金膜表面，進行後續的近紅外光譜定量脂質，其中使用近紅外光源激發綠球藻樣本，並以超低溫偵測器(deep-cooled detector)擷取所得的拉曼散射訊號。
    結果如圖1所示，乾燥粉末狀的綠球藻樣本，於200 cm-1至1800 cm-1的波數位移(wave number shift)範圍中共有八個主要的拉曼訊號峰，其中五個訊號主要因脂質(1266 cm-1、1302 cm-1、1440 cm-1、1660 cm-1、以及1749 cm-1)所造成，參考下表一。
    (參考Schulz & Baranska,2007；wood et al.,2005；Wu et al.,2011)
    由脂質造成的位移代表分子間不同的振動模式：順式=C-H平面形變(cis=C-H in plane deformation，1266 cm-1)、CH2扭轉動作(CH2 twisting motion，1302 cm-1)、CH2剪力形變(CH2 scissoring deformation，1440 cm-1)、以及順式C=C拉伸(cis C=C stretching，1660 cm-1)。在實施例一至實施例四中，亦即於脂質總含量5%至65%的綠球藻乾燥粉末樣本中，皆可以觀察出1440 cm-1以及1660 cm-1的波數位移訊號；但倘若綠球藻乾燥粉末樣本內脂質總含量低於15%，則因1266 cm-1、1302 cm-1、以及1749 cm-1的波數位移訊號過弱，而難以偵測該些位移訊號，且因1660 cm-1的波數位移訊號係因雙鍵所造成，故以1440 cm-1的波數位移訊號強度做為定量標準。
    再者，以實施例一至實施例四各綠球藻乾燥粉末中所含的脂質總含量做為X軸，於波數位移為1440 cm-1的拉曼訊號峰強度做為Y軸，繪製脂質檢量曲線，如圖2所示。由圖2可看出，綠球藻乾燥粉末中所含的脂質總含量與1440 cm-1波數位移的拉曼訊號峰強度，兩者之間具有相當高的相關係數(correlation coefficient，R2=0.97)，尤其當綠球藻乾燥粉末樣本的脂質總含量為15%以上時，訊號強度與脂質總含量兩者之間的關係更接近線性。此係證明利用近紅外光譜上的特定拉曼訊號(如波數位移為1440 cm-1的拉曼訊號峰強度)，可以針對綠球藻乾燥粉末中所含的脂質總含量進行定量。
    此外，參考圖3，其係同一批培養的三種樣本中拉曼訊號峰與訊號強度關係圖，每個數據皆有三次重覆。如圖3所示，同一批培養的不同樣本中，訊號強度的一致性良好，此即表示再現性極佳。 實施例五製實施例十一　以近紅外線光譜法進行漿狀樣本之脂質定量
    上述製備例一中累積脂質的綠球藻，先經過重量分析法測定後，確定七種綠球藻樣本中脂質總含量分別為各自綠球藻樣本乾重之14% wt(實施例五)、15% wt(實施例六)、25% wt(實施例七)、34% wt(實施例八)、38% wt(實施例九)、45% wt(實施例十)、以及63.8% wt(實施例十一)。
    將上述七種綠球藻樣本，以分光光度計測定波長685 nm之透光密度，並將其透光密度調整至約為4.3至4.6範圍內之預定透光密度後，取0.5 mL至2 mL範圍內之預定體積的綠球藻懸浮液，以12,000 rpm至15,000 rpm範圍內之預定轉速，離心預定時間(約3分鐘至10分鐘範圍)，以去除多餘的液體而形成漿狀樣本。
    取一玻璃載玻片置於電子束蒸鍍機(E-beam evaporator，ULVAC，VT1-10CE，Japan)，於該玻璃載玻片表面形成一薄金膜(大約150至250)，如此則形成可用於近紅外線光譜測定脂質的基板。將上述離心所得的漿狀樣本，塗覆於玻璃載玻片的金膜表面，塗覆直徑約0.25公分至1公分的量，進行後續的近紅外光譜定量脂質，其中使用近紅外光源激發綠球藻樣本，並以超低溫偵測器擷取所得的拉曼散射訊號。
    結果參考圖4，其係實施例四以及實施例十一之近紅外光譜圖。如圖4所示，就算實施例五綠球藻漿狀樣本之脂質總含量高達63.8%，但其在光譜上整體訊號峰，包括波數位移為1266 cm-1、1302 cm-1、以及1749 cm-1的拉曼訊號峰，其強度皆弱於實施例四綠球藻冷凍乾燥粉末樣本對應訊號的強度。
    亦如上述實施例一至實施例四，以實施例五至實施例十各綠球藻漿狀樣本中所含的脂質總含量做為X軸，於波數位移為1440 cm-1的拉曼訊號峰強度、以及波數位移於2700 cm-1至3100 cm-1範圍內的拉曼訊號峰總強度做為Y軸，繪製脂質檢量曲線，如圖5所示。由圖5可看出，綠球藻漿狀樣本中，於波數位移為1440 cm-1的拉曼訊號峰強度與脂質總含量，並非如冷凍乾燥粉末樣本同樣具有相同的線性關係(R2=0.83)。曾有報導(Heraud et al.,2007)提到葉綠素會造成波數位移在1440 cm-1附近的拉曼訊號，其係與綠球藻脂質訊號峰重疊，且曾有報導(Thomas,Kim,and Cotton,1990)提到若以波長範圍介於406 nm至647 nm的光源激發含水樣本時，水分子的存在性會加強葉綠素所造成的拉曼訊號，而本發明使用近紅外光激發實施例五至實施例十一之漿狀樣本，因漿狀樣本中含有水分，因此實施例五至實施例十一亦可能發生相同的現象，如此會導致定出不精確的脂質總含量。
    既然波數位移為1440 cm-1的拉曼訊號峰強度會受水分子存在與否的影響，則將光譜範圍擴大至波數位移為3200 cm-1，並以波數位移於2700 cm-1至3100 cm-1範圍內的拉曼訊號峰總強度，做為樣本內脂質總含量的定量訊號。如圖5所示，波數位移於2700 cm-1至3100 cm-1範圍內的拉曼訊號峰總強度，則不像波數位移為1440 cm-1的拉曼訊號峰強度會因葉綠素而受到影響，且此範圍內的拉曼訊號峰總強度與綠球藻漿狀樣本中所含的脂質總含量，兩者之間具有相當高的線性關係(R2=0.98)。此係證明利用近紅外光譜上的特定拉曼訊號(如波數位移於2700 cm-1至3100 cm-1範圍內的拉曼訊號峰總強度)，即使樣本中含有水份，仍可以針對樣本中所含的脂質總含量進行定量。
    參考圖6，其係訊號強度(即波數位移於2700 cm-1至3100 cm-1範圍內的拉曼訊號峰總強度)與綠球藻含量的關係圖，其中對於漿狀樣本中綠球藻的含量(O.D.×mL)，則藉由測定波長685 nm(由葉綠素吸收的波長)之透光密度來換算。如圖6所示，當綠球藻相對細胞數量增加時，訊號強度亦隨之增加。一般認為拉曼光譜法針對特定物質進行定量時，易面臨不同樣本間不具一致性的問題，但已有學者(Wu et al.,2011)認為針對特定物質之定量，可以使用比例量測法(ratio metric method)定出其對應另一成份的相對含量。據此，儘管綠球藻細胞狀態會因培養基組成在缺氮期間有所變動，但倘若樣本調整成具有相同的透光密度，則脂質總含量與訊號強度則會保持線性，因此透光密度可以取代拉曼光譜內的標準訊號峰，做為微藻類脂質總含量定量過程中的校正參考值。
    上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
    圖1係本發明實施例一至實施例四中，綠球藻乾燥粉末樣本的近紅外光譜圖。
    圖2係本發明實施例一至實施例四中，綠球藻乾燥粉末樣本的脂質總含量之脂質檢量曲線。
    圖3係本發明同一批培養的三種樣本中，拉曼訊號峰與訊號強度之關係圖。
    圖4係本發明實施例四綠球藻乾燥粉末樣本以及實施例十一之綠球藻漿狀樣本之近紅外光譜圖。
    圖5係本發明實施例五至實施例十中，綠球藻漿狀樣本的脂質總含量之脂質檢量曲線。
    圖6係本發明近紅外光譜中訊號強度與綠球藻含量的關係圖。
    权利要求:
    Claims (11)
    [1] 一種微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，包括以下步驟：提供一微藻類樣本以及一基板，其中該基板表面覆蓋一金屬層；將該微藻類樣本塗佈於該基板之該金屬層表面；提供一近紅外光波長之雷射光激發該微藻類樣本；紀錄該微藻類樣本之拉曼散射訊號，以形成一拉曼光譜；以及根據一脂質檢量曲線，將該拉曼光譜中之脂質訊號的強度轉換成該微藻類樣本之總脂質總含量。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該微藻類樣本係乾燥樣本或漿態樣本。
    [3] 如申請專利範圍第2項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該微藻類樣本係經過離心而製得的漿態樣本。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該近紅外光波長係介於750 nm至3200 nm。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該微藻類樣本之藻類係綠球藻屬(Chlorella)。
    [6] 如申請專利範圍第5項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該微藻類係綠球藻(Chlorella vulgaris)。
    [7] 如申請專利範圍第1項中所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該脂質檢量曲線係一脂質訊號強度與脂質總含量的曲線。
    [8] 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該脂質訊號位於該拉曼光譜中介於800 cm-1至3200 cm-1之波數位移(wave number shift)範圍。
    [9] 如申請專利範圍第8項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該脂質訊號位於該拉曼光譜中介於1400 cm-1至1600 cm-1之波數位移範圍或於2700 cm-1至3100 cm-1之波數位移範圍。
    [10] 如申請專利範圍第8項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該微藻類樣本係漿態樣本，且該脂質訊號位於該拉曼光譜中介於2700 cm-1至3100 cm-1之波數位移範圍。
    [11] 如申請專利範圍第8項所述之微藻總脂質之近紅外光譜定量方法，其中，該微藻類樣本之透光密度係做為校正該拉曼光譜之標準訊號峰。
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    CN103940801A|2014-04-17|2014-07-23|中国科学院青岛生物能源与过程研究所|一种单细胞水平快速鉴定微藻的方法|
    法律状态:
    2019-10-01| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    TW100139131A|TWI421494B|2011-10-27|2011-10-27|微藻總脂質之近紅外光譜定量方法|TW100139131A| TWI421494B|2011-10-27|2011-10-27|微藻總脂質之近紅外光譜定量方法|
    US13/494,122| US20130109044A1|2011-10-27|2012-06-12|Quantification method for total amount of microalgal lipids by near-infrared raman spectrometry|
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